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發布于 2023-08-21
染色質免疫沉淀（ChIP）是一種研究蛋白質與染色質DNA相互作用的技術，根據不同目的既可用于鑒定互作蛋白，也可用于鑒定互作DNA。通常被用于表觀遺傳學研究，如通過ChIP檢測轉錄調節相關的組蛋白修飾。
操作步驟：
一、 樣品準備（操作樣品在冰上或4℃進行。）
對于懸浮細胞, 確保10 ml新鮮培養基中有合適數量的細胞，直接加37%甲醛至終濃度為1%。搖晃混勻后，室溫下搖床孵育10 min。
對于組織, 液氮充分研磨組織至粉末狀。然后轉移至15 ml或50 ml尖底管中，加入10 ml PBS（Cat No. PR20023）和 270 μl 37%甲醛至終濃度為1%。搖晃混勻后，室溫下搖床孵育10 min。
加入500 ul 2.5 M甘氨酸（至終濃度0.125 M）終止反應，室溫孵育5 min。
細胞轉至50 ml尖底管中，4℃、2500 rpm離心5 min。
棄上清，冰預冷PBS（pH 7.4）洗滌細胞2次，每次洗滌后4℃、2500 rpm離心5 min。
用1 ml冰預冷細胞裂解液（Cat No. PR20001，現加蛋白酶抑制劑（Cat No. PR20016）），重懸細胞。為促進細胞膜的破裂，用Douncer玻璃勻漿器勻漿細胞5~10次，4℃孵育15 min。
4℃、4000 rpm離心5 min，棄上清。
細胞裂解液重新細胞核 (每3-5 x 106 個細胞加100 ul裂解液)。
冰上超聲5~15 min(25%功率，超聲20s、停30s)，最佳超聲條件需要根據預實驗確定。
4℃、12000 rpm離心5 min，轉移上清至新EP管中，直接進行后續試驗，或凍存-20℃備用。
二、DNA斷裂效果檢測
取50 ul染色質上清，加入150 ul ddH2O，10 ul 5M NaCl，65 ℃ 4 h或過夜，解交聯。
加入RNaseA至終濃度50 μg/ml，37 ℃孵育30 min。
加入Proteinase K至終濃度50 μg/ml，42 ℃孵育30 min。
劑盒純化DNA片段。
1.5 %瓊脂糖膠電泳檢測。
三、免疫沉淀（按單個CHIP反應）
準備70 ul磁珠。
用600 μl含5 %BSA的PBS，洗滌磁珠2次。
第二次洗滌后，重懸磁珠至初始體積。
取100 ul細胞裂解物（約含20 ug 染色質，具體因細胞及制樣不同而異），1:10稀釋至1 ml。
取25 ul洗好的磁珠，加至細胞裂解物中，進行lysate 預吸附處理。
剩余45 ul磁珠，加入2-5 ug相應抗體，4 ℃旋轉孵育過夜。（使用非特異性的IgG，作為陰性抗體對照）。
將步驟5 中樣品，磁性分離，轉移預吸附后的lysate至新EP管中。
用300 ul 冰預冷的 PBS（含5% BSA），洗滌步驟6后的抗體-磁珠復合物2次，棄上清。
加入預吸附后的lysate（留50 ul凍存備用）至抗體-磁珠復合物中，4 ℃旋轉孵育2 h。
瞬離樣品，然后置于磁力架上。
每次1 ml低鹽洗滌液，洗滌2次。
每次1 ml高鹽洗滌液，洗滌2次。
每次1 ml LiCl洗滌液，洗滌2次。
每次1 ml TE溶液，洗滌2次。第2次洗滌時，轉移樣品至新EP管中。
最后洗滌結束，移液器盡棄洗滌液。
準備Elution buffer，恒溫浴調至65 ℃。
加入100 ul Elution buffer至每個樣品中（步驟15后），65 ℃孵育10 min。
轉移洗脫液至新EP管，并重復步驟17一次，最終收集到200 ul。
取之前預吸附后的lysate 50 ul，作為 5% Input。補加150 ul Elution buffer，至總體積200 ul。
分別向CHIP洗脫樣品（步驟18后）和Input中加入10 ul NaCl（5 M 母液），65 ℃孵育過夜進行解交聯。
四、DNA純化和分析：
加入Proteinase K至終濃度50 μg/ml，42 ℃孵育1 h。
試劑盒純化DNA片段。
PCR檢測及分析。